激光共聚焦顯微鏡技術(shù)
激光共聚焦顯微鏡技術(shù)（Confocal Lasers Scanning Miccruscope CLSM)是將顯微鏡技術(shù)與激光技術(shù)有效的結(jié)合，對具有熒光標記的物的形態(tài)及功能，通過計算機控制可以對其單層面進行快速掃描，也可以對多個層面進行連續(xù)光片層掃描。逐層獲得二維光學橫斷面圖像，并可通過計算機三維重組軟件支持，獲得真三維圖像。
激光共聚焦顯微鏡匯集了激光技術(shù)、顯微鏡技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、計算機及圖像處理技術(shù)、精密的機械技術(shù)等，高、精、尖細胞分析及工程技術(shù)于一體的新技術(shù)。使其成為形態(tài)學、分子細胞生物學、神經(jīng)科學、藥理學、遺傳學等領(lǐng)域中新一代強有力的研究工具。
我們大家知道，從人類制作的第一臺顯微鏡到現(xiàn)在以有幾百年的歷史來了，隨著人類對生命科學研究的不斷深入，各種顯微鏡應運而生，使得研究細胞的手段以更加精密化和多樣化。共聚焦顯微鏡的理論是在1957年Marvin Minsky提出的，但共聚焦顯微鏡作為商品推出是在20世紀80年代初期，早期的激光共聚焦顯微鏡在技術(shù)上很不完善，其應用也受到限制。至到20世紀80年代末，光學系統(tǒng)設(shè)計不斷改進，成像的質(zhì)量和靈敏度都有所提高，進入90年代初，激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)中逐步引入混合激光和紫外激光技術(shù)。90年代末由美國Meridian公司推出的新型激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)，已具備完善的光學系統(tǒng)，模塊化的儀器設(shè)計，靈活的軟件和高配置的計算機硬件，從而使共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的功能不斷升級，應用的領(lǐng)域不斷擴展。隨著生命科學研究的不斷深入及熒光探針技術(shù)的迅速發(fā)展，共聚焦顯微鏡將推動生命科學研究的迅速發(fā)展，同時生命科學研究的進展也將使激光顯微鏡技術(shù)不斷改進和完善。
激光共聚焦顯微鏡是現(xiàn)今最為先進的光學顯微鏡，其主要優(yōu)點為：以激光為光源，在相應的熒光探針標記后，對樣本進行逐點掃描，逐層獲得二維光學橫斷面圖像，具有“細胞CT”的功能，并可通過計算機三維重建軟件支持，獲得真三維圖像，并可以任意角度旋轉(zhuǎn)，觀察細胞，組織立體形態(tài)和空間關(guān)系；可以對活細胞和組織進行無損傷的觀察，動態(tài)測量細胞內(nèi)的Ca離子濃度和pH值等活細胞生理信息；可對細胞膜的流動性，細胞間通訊，細胞融合，細胞骨架彈性測量等，可用作“光刀子”完成細胞內(nèi)“外科手術(shù)”。這一技術(shù)使得對活細胞和組織進行原位，動態(tài)，定量的觀察和測量的夢想成為現(xiàn)實。
第一章 光學顯微鏡顯微鏡的基本原理
我們大家知道，“工欲善其事，必先利其器”光學顯微鏡不僅是發(fā)現(xiàn)細胞的必要手段，也是生命科學研究基本技術(shù)條件。
第一節(jié) 普通顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)和原理
普通顯微鏡利用光線照明，標本中的各點以其光吸收（即光的振幅發(fā)生變化）的不同而在明亮的背景中成像。它是由光學系統(tǒng)；機械系統(tǒng)；光源組成。
（一）光學系統(tǒng)
1． 目鏡 它是插在目鏡筒頂部的鏡頭，由一組透鏡組成，可以使物鏡成倍地分辨、放大物像，例如10X、15X等。按照所能看到的視場大小，目鏡可分為視場較小的普通目鏡，和視場較大的大視場目鏡(或稱廣角目鏡)兩類。較高檔顯微鏡的目鏡上還裝有視度調(diào)節(jié)機構(gòu)，操作者可以方便快捷地對左右眼分別進行視度調(diào)整；此外，在這些目鏡上可以加裝測量分劃板，測量分劃板的象總能清晰地調(diào)焦在標本的焦面上；并且，為了防止目鏡被取走以及減少運輸中被損壞的可能性，這些目鏡可以被鎖定。
2． 物鏡 它安裝在轉(zhuǎn)換器的孔上，也是由一組透鏡組成的，能夠把物體清晰地放大。物鏡上刻有放大倍數(shù)，主要有10X、20X、40X、60X 100X等。高倍物鏡中多采用浸液物鏡，即在物鏡的下表面和標本片的上表面之間填充折射率為1.4左右的液體（如杉木油），它能顯著的提高顯微觀察的分辨率。
物鏡的主要參數(shù)：
放大率
放大率就是放大倍數(shù)，是指被檢驗物體經(jīng)物鏡放大再經(jīng)目鏡放大后，人眼所看到的最終圖象的大小對原物體大小的比值。是物鏡和目鏡放大倍數(shù)的乘積。放大率也是顯微鏡的重要參數(shù)，但也不能盲目相信放大率越高越好，在選擇時應首先考慮物鏡的數(shù)值孔徑。
數(shù)值孔徑：
數(shù)值孔徑簡寫NA，數(shù)值孔徑是物鏡和聚光鏡的主要技術(shù)參數(shù)，是判斷兩者（尤其對物鏡而言）性能高低的重要標志。其數(shù)值的大小，分別標科在物鏡和聚光鏡的外殼上。數(shù)值孔徑（NA）是物鏡前透鏡與被檢物體之間介質(zhì)的折射率（h）和孔徑角（u）半數(shù)的正玄之乘積。用公式表示如下：NA=hsinu/2
孔徑角又稱“鏡口角”，是物鏡光軸上的物體點與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度?？讖浇窃酱?，進入物鏡的光通亮就越大，它與物鏡的有效直徑成正比，與焦點的距離成反比。顯微鏡觀察時，若想增大NA值，孔徑角是無法增大的，唯一的辦法是增大介質(zhì)的折射率h值?；谶@一原理，就產(chǎn)生了水浸系物鏡和油浸物鏡，因介質(zhì)的折射率h值大于一，NA值就能大于一。數(shù)值孔徑最大值為1.4，這個數(shù)值在理論上和技術(shù)上都達到了極限。目前，有用折射率高的溴萘作介質(zhì)，溴萘的折射率為1.66,所以NA值可大于1.4。這里必須指出，為了充分發(fā)揮物鏡數(shù)值孔徑的作用，在觀察時，聚光鏡的NA值應等于或略大于物鏡的NA值，
數(shù)值孔徑與其他技術(shù)參數(shù)有著密切的關(guān)系，它幾乎決定和影響著其他各項技術(shù)參數(shù)。它與分辨率成正比，與放大率成正比，與焦深成反比，NA值增大，視場寬度與工作距離都會相應地變小。
分辨率：
分辨率又稱“鑒別率”，“解像力”。是衡量顯微鏡性能的又一個重要技術(shù)參數(shù)。顯微鏡的分辨率用公式表示為：d=l/NA式中d為最小分辨距離；l為光線的波長；NA為物鏡的數(shù)值孔徑?？梢娢镧R的分辨率是由物鏡的NA值與照明光源的波長兩個因素決定。NA值越大，照明光線波長越短，則d值越小，分辨率就越高。要提高分辨率，即減小d值，可采取以下措施
1．降低波長l值，使用短波長光源。
2．曾大介質(zhì)h值和提高NA值（NA=hsinu/2）。
3．增大孔徑角。
4．增加明暗反差。
焦深：
焦深為焦點深度的簡稱，即在使用顯微鏡時，當焦點對準某一物體時，不僅位于該點平面上的各點都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度內(nèi)，也能看得清楚，這個清楚部分的厚度就是焦深。
焦深大, 可以看到被檢物體的全層，而焦深小，則只能看到被檢物體的一薄層，焦深與其他技術(shù)參數(shù)有以下關(guān)系：
1．焦深與總放大倍數(shù)及物鏡的數(shù)值孔鏡成反比。
2．焦深大，分辨率降低。
視場直徑（Field of view）：
觀察顯微鏡時，所看到的明亮的原形范圍叫視場，它的大小，是由目鏡里的視場光闌決定的。視場直徑也稱視場寬度，是指在顯微鏡下看到的圓形視場內(nèi)所能容納被檢物體的實際范圍。視場直徑愈大，愈便于觀察。
1．視場直徑與視場數(shù)成正比。
2．增大物鏡的倍數(shù)，則視場直徑減小。因此，若在低倍鏡下可以看到被檢物體的全貌，而換成高倍物鏡，就只能看到被檢物體的很小一部份。
覆蓋差：
顯微鏡的光學系統(tǒng)也包括蓋玻片在內(nèi)。由于蓋玻片的厚度不標準，光線從蓋玻片進入空氣產(chǎn)生折射后的光路發(fā)生了改變，從而產(chǎn)生了相差，這就是覆蓋差。覆蓋差的產(chǎn)生影響了顯微鏡的成響質(zhì)量。國際上規(guī)定，蓋玻片的標準厚度為0.17mm, 許可范圍在0.16—0.18mm.,在物鏡的制造上已將此厚度范圍的相差計算在內(nèi)。物鏡外殼上標科的確0.17,即表明該物鏡要求蓋玻片的厚度。
工作距離：
工作距離也叫物距，即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離。鏡檢時，被檢物體應處在物鏡的一倍至二倍焦距之間。因此，它與焦距是兩個概念，平時習慣所說的調(diào)焦，實際上是調(diào)節(jié)工作距離。在物鏡數(shù)值孔徑一定的情況下，工作距離短孔徑角則大。數(shù)值孔徑大的高倍物鏡，其工作距離小。
3．光源 ：有鹵素燈、鎢絲燈、汞燈、熒光燈、金屬鹵化物燈等。
4．聚光器： 包括聚光鏡、孔徑光闌。聚光鏡由透鏡組成，它可以集中透射過來的光線，使更多的光能集中到被觀察的部位?？讖焦怅@可控制聚光器的通光范圍，用以調(diào)節(jié)光的強度。
（二）機械裝置
1． 機架 顯微鏡的主體部分，包括底座和彎臂。
2． 目鏡筒 位于機架上方，靠圓形燕尾槽與機架固定，目鏡插在其上。根據(jù)有否攝像功能，可分為雙目鏡筒和三目鏡筒；根據(jù)瞳距的調(diào)節(jié)方式不同，可分為鉸鏈式和平移式。
3． 物鏡轉(zhuǎn)換器 它是一個旋轉(zhuǎn)圓盤，上有3～5個孔，分別裝有低倍或高倍物鏡鏡頭。轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器就可讓不同倍率的物鏡進入工作光路。
4． 載物臺 是放置玻片的平臺，其中央具有通光孔。臺上有一個彈性的標本夾，用來夾住載玻片。右下方有移動手柄，使載物臺面可在XY雙方向進行移動。
5． 調(diào)焦機構(gòu) 利用調(diào)焦手輪可以驅(qū)動調(diào)焦機構(gòu)，使載物臺作粗調(diào)和微調(diào)的升降運動，從而使被觀察物體對焦清晰成像。
6． 聚光器調(diào)節(jié)機構(gòu) 聚光器安裝在其上，調(diào)節(jié)螺旋可以使聚光器升降，用以調(diào)節(jié)光線的強弱。
第二節(jié) 光學顯微鏡的分類
光學顯微鏡有多種分類方法：
按使用目鏡的數(shù)目可分為雙目和單目顯微鏡；按圖像是否有立體感可分為立體視覺和非立體視覺顯微鏡；按觀察對像可分為生物和金相顯微鏡等；按光學原理可分為偏光、相襯和微差干涉對比顯微鏡等；
按光源類型可分為普通光、熒光、紫外光、紅外光和激光顯微鏡等；按接收器類型可分為目視、數(shù)碼（攝像）顯微鏡等。常用的顯微鏡有雙目體視顯微鏡、金相顯微鏡、偏光顯微鏡、熒光顯微鏡等。
第二章 熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)和原理第一節(jié) 熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)和原理
熒光顯微鏡是利用較短波長的光是樣品受到激發(fā)，產(chǎn)生較長波的熒光，可用來觀察和分辨樣品中產(chǎn)生熒光物質(zhì)的成分和位置。任何一種熒光物質(zhì)都有的有的吸收光譜和發(fā)射光譜，熒光發(fā)射光譜比吸收光譜的波長偏長波方向，但二者有部分重疊。
熒光顯微鏡是利用一個高發(fā)光效率的點光源，經(jīng)過濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長的光(如紫外光365或紫藍光420)作為激發(fā)光、激發(fā)標本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再通過物鏡和目鏡的放大進行觀察。這樣在強烈的對襯背景下，即使熒光很微弱也易辨認，敏感性高，主要用于細胞結(jié)構(gòu)和功能以及化學成分等的研究。熒光顯微鏡的基本構(gòu)造是由普通光學顯微鏡加上一些附件(如熒光光源 、激發(fā)濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎(chǔ)上組成的。熒光光源——般采用超高壓汞燈(50一200W)，它可發(fā)出各種波長的光，但每種熒光物質(zhì)都有一個產(chǎn)生最強熒光的激發(fā)光波長，所以需加用激發(fā)濾片（一般有紫外、紫色、藍色和綠色激發(fā)濾片），僅使一定波長的激發(fā)光透過照射到標本上，而將其他光都吸收掉。每種物質(zhì)被激發(fā)光照射后，在極短時間內(nèi)發(fā)射出較照射波長更長的可見熒光。熒光具有專一性，一般都比激發(fā)光弱，為能觀察到專一的熒光，在物鏡后面需加阻斷(或壓制)濾光片。它的作用有二：一是吸收和阻擋激發(fā)光進入目鏡、以免于擾熒光和損傷眼睛，二是選擇并讓特異的熒光透過，表現(xiàn)出專一的熒光色彩。兩種濾光片必須選擇配合使用。
（一）光源
高壓汞燈或氙燈是常用的熒光激發(fā)光源，汞燈在366nm 、405nm、436nm、546nm、577nm處有很強的發(fā)射線；氙燈也在光的紫外區(qū)、可見區(qū)有較強的發(fā)射線。
（二）光學系統(tǒng)
（1）物鏡由于激發(fā)標本和收集熒光都是由同一物鏡實現(xiàn)的，所以物鏡的選擇尤為重要，我們選擇的標準是能透過紫外光的特制物鏡，熒光效率與所用物鏡數(shù)值孔徑的4次方成正比，所以用數(shù)值孔徑較大浸油物鏡效果較好。
（2）目鏡熒光亮度與目鏡放大倍數(shù)的平方成反比。
（3）激發(fā)濾片放置于光源和物體之間，其作用是選擇適宜于激發(fā)欲觀察熒光物質(zhì)的波長范圍。
（4）阻斷濾片采用長波通濾片，即使長于某波長的光通過，短于某波長的光不能通過，進一步使熒光與激發(fā)光分離，已獲更純的熒光。內(nèi)阻斷鋁片以固定在內(nèi)部，外阻斷濾片可跟需要裝入或卸下。
（5）雙色反色鏡他放置方向與激發(fā)光的方向呈45°，具有一個特定波長值m。波長長于m的光被透射，波長短于m的光波被反射，所以它是初分離激發(fā)光（較短波長）和發(fā)射熒光（較長波長）的一個重要組件。
第二節(jié) 熒光顯微鏡的分類及使用注意事項
（一）熒光顯微鏡一般分為透射和落射式兩種類型。
a. 透射式：激發(fā)光來自被檢物體的下方，聚光鏡為暗視野聚光鏡，使激發(fā)光不進入物鏡，而使熒光進入物鏡。它在低倍情況下明亮，而高倍則暗，在油浸和調(diào)中時，較難操作，尤以低倍的照明范圍難于確定，但能得到很暗的視野背景。透射式不使用于非透明的被檢物體。
b. 落射式：透射式目前幾乎被淘汰，新型的熒光顯微鏡多為落射式，光源來自被檢物體的上方，在光路中具有分光鏡，所以對透明和不透明的被檢物體都適用。由于物鏡起了聚光鏡的作用，不僅便于操作，而且從低倍到高倍，可以實現(xiàn)整個視場的均勻照明。
（二）熒光鏡檢術(shù)的注意事項
a. 激發(fā)光長時間的照射，會發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象，因此盡可能縮短觀察時間，暫時不觀察時，應用擋板遮蓋激發(fā)光。
b. 作油鏡觀察時，應用"無熒光油"。
c. 熒光幾乎都較弱，應在較暗的室內(nèi)進行。
d. 電源最好裝穩(wěn)壓器，否則電壓不穩(wěn)不僅會降低汞燈的壽命，也會影響鏡檢的效果。
目前許多新興生物研究領(lǐng)域應用到熒光顯微鏡，如基因原位雜交（FISH）等等。
第三章 激光共聚焦顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)
激光共聚焦顯微鏡主要是由 激光照射系統(tǒng)（氬離子激光氣器、氦乃紅、氦乃綠激光器和聲光調(diào)節(jié)器）、顯微鏡系統(tǒng)（倒或正置熒光顯微鏡和共聚焦系統(tǒng)組成）、檢測系統(tǒng)（檢測器和檢測放大器）、X-Y平臺系統(tǒng)、Z軸步進馬達、計算機系統(tǒng)
（一） 激光照射系統(tǒng)
激光器是一種產(chǎn)生激光束的裝置，它保證光子在其中持續(xù)震蕩、反復放大得到大量的特征相同的光子，從而產(chǎn)生持續(xù)不斷的激光束。迄今為止，在21nm～7mm范圍內(nèi)，用各種激光器可產(chǎn)生幾千個激光波長，但其中只有少量譜線能夠用作共聚焦顯微鏡的光源。通常采用的激光譜線有：Ar-458nm，476nm，488nm，514nm；Kr-568nm、647nm，HeNe-543nm、633nm;Ar(UV)-351nm、364nm為紫外光線；藍紫光半導體激光器發(fā)出405nm的激光。作為激光光源可單獨或同時配備多個激光器，以獲得更多的激光譜線，滿足大多數(shù)常用熒光探針的需要。因此，不同的儀器激光譜線數(shù)目及功率的大小根據(jù)所配置的激光器不同而有所差異。選配合理，基本能滿足多種熒光物質(zhì)的測定。
（二） 顯微鏡系統(tǒng)
熒光顯微鏡是激光掃描共聚焦顯微鏡的一個重要組成部分。它配備兩個光源：鹵素燈光源和汞燈光源，主要是用于預覽樣品，其中鹵素燈光源用于尋找樣品焦平面、觀察樣品位置、形態(tài)和分布；汞燈用于觀察和分辨樣品中產(chǎn)生熒光物質(zhì)的成分和位置。對于光敏（例如淬滅）的樣品最好用鹵素燈進行預覽，以減少對樣品的刺激。激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)所用的熒光顯微鏡大體與常規(guī)熒光顯微鏡相同，但是又有其特點。
（1）激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)中，其側(cè)面打開了一個于掃描器相連接的接口，使激光能夠由此進入顯微鏡的物鏡照射到樣品上，并使樣品發(fā)射的螢光到達檢測器。
（2）熒光顯微鏡的載物臺上裝有微量步進馬達，以驅(qū)動載物臺在垂直（z軸）方向移動，用于共聚焦顯微鏡獲取不同層面光學切片，這些光學切片是共聚焦顯微鏡獲取三維熒光圖像的基礎(chǔ)。Z軸步距的大小決定了光學切片的厚度，而z軸的步距是由實驗者輸入相應的指令來控制的。
（3）用高倍鏡觀察樣品尤其是進行動態(tài)監(jiān)測時，最好配備倒置顯微鏡，以便適應多種樣品的觀察，例如Petri 皿中培養(yǎng)的細胞樣品。
（4）熒光鏡座要裝有防震動的裝置，防止在激光掃描樣品、采集圖像過程中發(fā)生載物臺在任何方向上的移動。
（5）裝有光路轉(zhuǎn)換裝置。預覽時使用汞燈作為激發(fā)光，樣品發(fā)射的熒光進入目鏡或照相系統(tǒng)；正式采集共焦圖像時用激光光源激發(fā)樣品，發(fā)射的熒光進入掃描頭中的檢測器。這兩套激發(fā)光源及發(fā)射光系統(tǒng)不能同時使用，要配備光學和機械系統(tǒng)進行光路轉(zhuǎn)換。
（6）要配備高數(shù)值孔徑的油浸或水浸物鏡采集樣品精細機構(gòu)的圖像。顯微鏡物鏡鏡頭及光路系統(tǒng)均與掃描器光路系統(tǒng)相匹配，同時由于各種波長的激發(fā)光和熒光都通過物鏡，所以物鏡要保證各波長范圍內(nèi)的透光性。
(7) 汞燈光線的強度可調(diào)，以便根據(jù)樣品中熒光物質(zhì)的強弱及光敏的程度調(diào)節(jié)激發(fā)光的強度，保證樣品在預覽過程中的熒光強度不發(fā)生變化，這對于后面用共聚焦顯微鏡進一步準確定量很重要。
（8）載物臺支架和附件的配備要能適應多種樣品器皿和測試要求。因此需要配備相應的支架和附件。常用的樣品支架有：載玻片支架、大小Petri皿支架、大小平皿支架、控溫架CO2。通氣裝置等。
（9）熒光顯微鏡的參數(shù)要與光路系統(tǒng)。計算機控制軟件系統(tǒng)相匹配。
（三）計算機系統(tǒng)
共聚焦顯微鏡儀器的各個部分由計算機予以設(shè)置和調(diào)控，使光線精確地按照設(shè)計要求掃描樣品，多有檢測信號均可被存于多維的圖像儲存器內(nèi)，并對圖像資料作進一步的加工處理。計算機還可以存儲測定樣品的條件，以便重復試驗。共焦圖像文件大，每一幅單色圖像要處理256kb以上，而且每一次采集圖像，一般需要將幾幅甚至上百幅圖像作為一個文件存儲，因此對計算機軟件功能、運行速度，內(nèi)存、硬盤要求很高，近幾年來計算機軟件功能日益強大，運行速度快，內(nèi)存、硬盤存儲容量大，基本滿足了激光共聚焦顯微鏡技術(shù)的要求。
第二節(jié) 激光共聚焦顯微鏡基本原理
激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理如圖1所示，激光器發(fā)出的激光束經(jīng)過擴束透鏡和光束整形鏡，變成一束直徑較大的平行光束，長通分色反射鏡使光束偏轉(zhuǎn)90度，經(jīng)過物鏡會聚在物鏡的焦點上，樣品中的熒光物質(zhì)在激光的激發(fā)下發(fā)射沿各個方向的熒光，一部分熒光經(jīng)過物鏡、長通分色反射鏡、聚焦透鏡、會聚在聚焦物鏡的焦點處，再通過焦點處的針孔，由檢測器接收。
第三節(jié) 共聚焦顯微鏡系統(tǒng)優(yōu)點
可對固定或者活的細胞、組織切片進行連續(xù)斷層掃描，獲得精細的細胞骨架、染色體、細胞器、細胞膜等系統(tǒng)的三維圖像，
高水平分辨率
普通顯微鏡 0.61λ/NA；共聚焦顯微鏡 0.55λ/NA
實時多通道熒光（熒光平衡）、透射DIC觀測
數(shù)字化圖像，可以進行圖像處理和定量分析
離子濃度測定，即檢測細胞內(nèi)鈉、鈣、鎂、pH等離子濃度及觀察其動態(tài)變化
光譜功能；光誘導功能；熒光壽命成像功能；活體多光子顯微觀察功能。
共聚焦顯微技術(shù)應用
細胞生物學如：細胞結(jié)構(gòu)、細胞骨架、細胞膜結(jié)構(gòu)、流動性、受體、細胞器結(jié)構(gòu)和分布變化、細胞凋亡機制；各種細胞器、結(jié)構(gòu)性蛋白、DNA、RNA、酶和受體分子等細胞特異性結(jié)構(gòu)的含量、組分及分布進行定量分析；利用特定的抗體對紫外線引起的DNA損傷進行觀察和定量；分析正常細胞與癌細胞的細胞骨架及其與核改變之間的關(guān)系；細胞黏附行為等
生物化學如：酶、核酸、受體分析、熒光原位雜交、染色體基因定位等，利用共聚焦技術(shù)可以取代傳統(tǒng)的核酸印跡染交等技術(shù)，進行基因的表達檢測，使基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯等檢測變的更加簡單、準確
藥理學如：藥物對細胞的作用及其動力學；藥物進入細胞的動態(tài)過程、定位分布及定量分析
生理學、發(fā)育生物學如：膜受體，離子通道，離子含量、分布與動態(tài)變化；動物發(fā)育以及胚胎的形成，干細胞的分化等；細胞膜電位的測量，熒光漂白后恢復（FRAP）的測量等。
遺傳學和組胚學如：細胞生長、分化，細胞的三維結(jié)構(gòu)，染色體分析，基因表達，基因診斷等
神經(jīng)生物學如：神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)，神經(jīng)遞質(zhì)的成分、運輸和傳遞
微生物學和寄生蟲學如：細菌、寄生蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)
病理學及病理學臨床應用如：活檢標本的快速診斷，腫瘤診斷，自身免疫性疾病的診斷
免疫學、環(huán)境醫(yī)學和營養(yǎng)學如：免疫熒光標記（單標、雙標或三標）的定位，細胞膜受體或抗原的分布，微絲、微管的分布，兩種以上蛋白的共存與共定位，蛋白與細胞器的共定位，動態(tài)實時原位跟蹤特定蛋白在細胞生長、分裂、分化過程中的時空表達等