在烏頭類生藥及炮制品中，生物堿成分既是藥效成分同時也是毒性成分［1］，而且穩(wěn)定性不好，很容易降解［2］，所以生物堿的提取方法在其成分分析中十分重要。目前有關(guān)生物堿的提取方法有很多［3～5］，但是，各種方法對雙酯型生物堿的提取效率的比較研究尚無報道。中醫(yī)臨床常用的烏頭類中藥為附子的炮制品，市售的附子炮制品飲片按不同的炮制方法分為鹽附子、黑附片、白附片、淡附子、熟附片及炮附子等［6］，但是，不同的炮制方法，必然會造成生物堿含量的不同，在使用上應(yīng)有所區(qū)別。本文比較了7種提取方法對烏頭類中藥中3種雙酯型生物堿的提取效率，并測定烏頭類生藥及其炮制品中烏頭類生物堿含量，以期準(zhǔn)確測定附子中生物堿,為保證此類中藥的臨床應(yīng)用更為安全合理提供可靠的分析方法。
1儀器與試劑
1.1儀器LC-10A高效液相儀（Shimadzu，日本）；超聲清洗器（Autoscience,天津）；高速離心機（Eppendorf，德國）；電子天平（Sartorius，德國）。
1.2試劑烏頭堿，中烏頭堿和次烏頭堿對照品購自中國藥品生物制品檢定所。生附子、生草烏購自四川江油，制草烏、黑附片、白附片、鹽附子、淡附子購自吉林省長春市吉深藥店，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定均為正品。甲醇為色譜純,水為去離子水，乙醚、二氯甲烷等其他試劑為分析純。
2方法與結(jié)果
2.1方法學(xué)考查
2.1.1色譜條件AgilentextendedC18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動相為甲醇∶0.1%三乙胺（65∶35）；流速為0.6ml·min-1；檢測波長為230nm；柱溫為30℃；樣品經(jīng)過0.45μm微孔濾膜過濾，濾液進樣10μl。
2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線精密稱取中烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿對照品適量置于容量瓶中，加入二氯甲烷溶解并定容，得濃度為1.08mg·ml-1的中烏頭堿、1.12mg·ml-1的烏頭堿和1.22mg·ml-1的次烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。每種對照品溶液分別進樣2，4，6，8，10μl，高效液相色譜法測定。以濃度（μg·ml-1）對峰面積計算回歸曲線。得到中烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=20672.0X-58377.5，r=0.9995；烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=18114.2X-28544.2，r=0.9999；次烏頭堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=186632X-13386.7，r=0.9993。說明烏頭堿在5.6～112μg·ml-1、中烏頭堿在5.4～108μg·ml-1，次烏頭堿在6.1～122μg·ml-1的濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性。
2.1.3重復(fù)性實驗同一生草烏粉末按優(yōu)選的提取方法操作，提取6份溶液，HPLC測定，記錄烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿峰面積。烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿含量的RSD值分別為4.32%，3.57%和4.84%。說明方法重復(fù)性較好。
2.1.4回收率實驗精密稱取已知含量的生草烏粉末18份，每份0.2g。第1個6份分別加入0.05mg烏頭堿，第2個6份分別加入0.4mg中烏頭堿，第3個6份分別加入0.2mg次烏頭堿，同法操作計算含量，烏頭堿的平均回收率為91.2%，RSD值為2.84%；中烏頭堿的平均回收率為90.4%，RSD值為3.12%；次烏頭堿的平均回收率為92.8%，RSD值為3.10。表明方法回收率較好。
2.1.5穩(wěn)定性實驗同一生草烏粉末樣品溶液保存于-80℃冰箱中，于放入冰箱后第4，8，12，18，24小時測定，計算含量。24h內(nèi)烏頭堿、中烏頭堿和中烏頭堿含量的RSD值分別為5.21%，4.35%和6.24%。表明提取液在-80℃冰箱中24h內(nèi)較穩(wěn)定。
2.2提取方法的優(yōu)選
2.2.1水提氯仿萃取法稱生草烏2.0g于帶塞錐形瓶中，加30ml蒸餾水，振蕩6h后，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，3000r·min-1離心20min，取上清液，沉淀水洗2次，合并上清液，用10%氨水調(diào)pH值為10，分別加入15，5，5ml氯仿萃取3次，合并氯仿層，蒸干。加甲醇溶解，定容至25ml。
2.2.2酸提法稱生草烏2.0g于帶塞錐形瓶中，加30ml0.04%HCl，振蕩6h，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，3000r·min-1離心20min，取上清液，沉淀用0.04%HCl洗2次，合并上清液，加0.04%HCl定容至50ml。
2.2.3酸提乙醚萃取法稱生草烏2.0g于帶塞錐形瓶中，加30ml0.04%HCl，振蕩6h，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，3000r·min-1離心20min，取上清液，沉淀0.04%HCl洗2次，合并上清液，用10%氨水調(diào)pH值為10，加入15，5，5ml乙醚萃取3次，合并乙醚層，蒸干。加甲醇溶解，定容至25ml。
2.2.4酸提氯仿萃取法稱生草烏2.0g于帶塞錐形瓶中，加30ml0.04%HCl，振蕩6h，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，3000r·min-1離心20min，取上清液，沉淀用0.04%HCl洗2次，合并上清液，用10%氨水調(diào)pH值為10，加入15，5，5ml氯仿萃取3次，合并氯仿層，蒸干。加甲醇溶解，定容至25ml。
2.2.5氨水乙醚冷浸法稱生草烏2.0g于帶塞錐形瓶中，加4ml10%氨水，加30ml乙醚，振蕩5min，冷浸6h，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，3000r·min-1離心5min，取乙醚層，沉淀用乙醚洗2次，合并乙醚層，蒸干。加甲醇溶解，定容至25ml。
2.2.6氨水乙醚超聲提取法稱生草烏2.0g于帶塞錐形瓶中，加4ml10%氨水，加30ml乙醚，超聲30min，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，3000r·min-1離心5min，取乙醚層，沉淀用乙醚洗2次，合并乙醚層，蒸干。加甲醇溶解，定容至25ml。
2.2.7酸超聲提氯仿萃取法稱生草烏2.0g于帶塞錐形瓶中,加30ml0.04%HCl，超聲30min，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，3000r·min-1離心20min，取上清液，沉淀5ml0.04%HCl洗2次，合并上清液，用10%氨水調(diào)pH值為10，加入15，5，5ml氯仿萃取3次，合并氯仿層，蒸干。加甲醇溶解，定容至25ml，。
采用“2.1.1”項下的色譜條件對上述7種提取方法所得樣品進行含量測定。得到結(jié)果見表1。各種提取方法的提取率（3種生物堿之和）順序為：氨乙醚冷浸>酸提>酸超聲提氯仿萃取>氨乙醚超聲提取>酸提氯仿萃取>酸提乙醚萃取>水提氯仿萃取。確定氨乙醚冷浸為最有效的提取方法。
表1不同提取方法雙酯型烏頭堿的含量（略）
2.3草烏、附子生藥及炮制品的含量分析分別準(zhǔn)確稱取白附片、炮附子、黑附片、淡附子、生草烏、生附子、制草烏粉末各0.4g，加10%氨水0.5ml潤濕，加乙醚10ml，浸泡過夜，取乙醚層，藥渣用乙醚1ml洗2次，合并乙醚層，蒸干，加色譜純甲醇定容至2ml。采用“2.1.1”項下的色譜條件對樣品進行測定。利用當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計算提取液中3種雙酯型生物堿的含量，每種樣品均取3份平行操作。實驗結(jié)果見表2。不同炮制方法得到的炮制品中各生物堿含量差別較大。生草烏、生附子及各炮制品中雙酯型生物堿的含量順序為，生草烏>生附子>制草烏>黑附片>淡附子>白附片>炮附子。
表2各種烏頭類中藥中烏頭類生物堿含量（略）
3討論
效率較高的烏頭類生物堿提取方法是氨乙醚和稀鹽酸提取法，這是由于烏頭堿類雙酯二萜生物堿的極性較小，易溶于乙醚、氯仿等有機溶劑。雖然烏頭類生物堿難溶于水，但是人們在服用烏頭屬中藥時基本采用水煎煮的方法，所以本實驗比較了分別以乙醚，氯仿和水為溶解的7種提取方法。
水提取氯仿萃取法提取率最低，這是烏頭類生物堿在水中的溶解度較低，不能全部被溶出的緣故。氨乙醚冷浸法的提取率最高，這是由于烏頭類生物堿在堿性的環(huán)境下以游離型存在，能充分溶于有機溶劑而被萃取出來。其余方法的提取率均低于氨乙醚冷浸法。烏頭類生物堿在酸性環(huán)境下成鹽導(dǎo)致水溶性增大（張洪貴.《毒性烏頭生物堿堿代謝產(chǎn)物研究》.吉林大學(xué)2006博士生畢業(yè)論文），故酸提法的提取率較高，但是烏頭堿在酸性水溶液中的溶解度仍然低于在乙醚中的溶解性。酸提乙醚萃取法和酸提氯仿萃取法由于在萃取的過程中，烏頭類生物堿被分配在水層一部分，導(dǎo)致提取不完全，所以提取率要低于氨乙醚冷浸法。氨乙醚超聲提取法和酸超聲提氯仿萃取法是由于在超聲的過程中，溶劑內(nèi)部產(chǎn)生的熱量導(dǎo)致不穩(wěn)定的烏頭類生物堿水解而使提取率下降。
炮制品與生藥相比較，提取液中雙酯型生物堿含量明顯減少，毒性大大降低。制草烏的各成分含量明顯高于其它炮制方法，因此在使用時應(yīng)適量。炮附子中雙酯型生物堿含量非常低，中烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿均未檢出，因此在烏頭類中藥臨床應(yīng)用中總結(jié)出來的“僅炮附子能大量入藥”，從化學(xué)成分分析上是合理的。