主要儀器試劑

儀器：微型電泳系統(tǒng)、電源、注射器、固定和染色用容器

試劑：丙稀酰胺、雙－丙稀酰胺、載體兩性電解質(zhì)、尿素、過(guò)硫酸胺、TEMED、TritonX－100、2－巰基乙醇、溴酚藍(lán)、磷酸、氫氧化鈉、氯化鉀、三氯乙酸、考馬斯亮藍(lán)、甲醇、乙酸。

儲(chǔ)存液：1）30%（w/v）丙稀酰胺，1%（w/v）雙－丙稀酰胺；2）20%Triton X100；3）10%三氯乙酸；4）1%三氯乙酸；5）1%溴酚藍(lán)；6）考馬斯亮藍(lán)染色液；7）考馬斯亮藍(lán)脫色液；

灌膠

以灌制8cm×7cm×0.75mm pH4-6變性等電聚焦凝膠的配方。其他pH范圍等電聚焦可以參考表格來(lái)配置。

水：5.4ml； 儲(chǔ)存液1）：2.0 ml； 載體兩性電解質(zhì)溶液pH3.5-10 48μl； 載體兩性電解質(zhì)溶液pH4-6 240μl； 超純尿素 6.0 g ；10%過(guò)硫酸胺25μl； TEMED：20μl

灌膠步驟：

1.組裝灌膠器；

2.將尿素、水、溶液和載體兩性電解質(zhì)溶液混勻，避免劇烈搖動(dòng)，輕微加熱尿素溶解更快（帶手套，丙稀酰胺有毒）；

3.加入過(guò)硫酸胺和TEMED，輕輕混勻（開(kāi)始聚合，操作要迅速）；

4.將上述混勻溶液倒如灌膠器（盡量避免氣泡產(chǎn)生）；

5.插入梳子，將梳子侵入膠內(nèi)（不要產(chǎn)生氣泡）；

6.聚合約1小時(shí)；

7.聚合完成，小心拔去梳子；

8.將凝膠同冷卻裝置連接后插入電泳池，蛋白樣品上樣前最好用陽(yáng)極電極液注入上槽中確定是否有滲漏。

注意：

1.上樣前沖去上樣空底部未聚合的丙稀酰胺，否則電泳過(guò)程中會(huì)發(fā)生聚合；

2.現(xiàn)在有商品化的等電聚焦凝膠，但只限于水平平板電泳系統(tǒng)（如Pharmmacia－LKB,Hoefer）.

樣品制備和上樣

一般不同厚度的凝膠，不同的梳孔數(shù)目會(huì)有不同的上樣量，例如：0.75mm厚、15孔的凝膠每孔最大上樣量大約15μl。

變性凝膠上樣緩沖液2×Buffer（適用于pH4-6）：1）尿素：2.4g；2）pH3.5-10載體兩性電解質(zhì)：20μl；3）pH4-6載體兩性電解質(zhì)：100μl；4）20%Triton X－100：500μl：5）2－巰基乙醇：50μl；雙蒸水：1.7ml；1%溴酚藍(lán)：200μl

電泳：

操作步驟：

1.將蛋白樣品于等體積的2×上樣緩沖液混合，10000×g離心5min以除去蛋白質(zhì)沉淀；

2.用微量注射器將蛋白質(zhì)樣品加入到上樣空底部，注意不要溢出來(lái)。注意：對(duì)于考馬斯亮藍(lán)染色液來(lái)說(shuō)，每個(gè)泳道10-30μg的蛋白混合粗提物（我們俗稱粗抗原）或者5-10μg單一蛋白組分是較合理的上樣濃度。

電泳液：

1.上槽中加入陰極電泳液（20mM氫氧化鈉：須由1M儲(chǔ)存液新鮮配置）；

2.下槽中加入陽(yáng)極電泳液（10mM磷酸：須由1M儲(chǔ)存液新鮮配置）。

等電聚焦電泳條件：

1.接好電極；

2.恒壓150V電泳30min；

3.恒壓200V電泳2.5h，開(kāi)始時(shí)候控制電流為10mA左右，在聚焦過(guò)程中電流有所下降，電泳內(nèi)室溫度在電泳的過(guò)程中將升至40－50攝氏度。

電泳聚焦后處理：

測(cè)定pH梯度：

1.將凝膠條切成0.5cm或1cm的小片；

2.將每小片凝膠在1ml 10mM KCl中 浸泡30min；

3.測(cè)讀此KCl溶液的pH值、

凝膠的固定：

1.將凝膠于10%三氯乙酸中浸泡10min；

2.換成1%三氯乙酸溶液繼續(xù)浸泡至少2h以上，以去除載體兩性電解質(zhì)，浸泡過(guò)夜可以更好的降低考馬斯亮藍(lán)對(duì)載體兩性電解質(zhì)的染色。

凝膠的染色：用考馬斯亮藍(lán)染色，然后脫色，制成干膠。
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DYCP-37B 等電聚焦多用途電泳槽
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等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)蛋白（pH3－pH10）試劑盒

所有的氨基酸均為兩性物質(zhì)，即它們至少含有一個(gè)羧基（carboxyl）及一個(gè)氨基（α-amino）。這些可游離的基團(tuán)隨著pH變化可以三種形式存在，即正電荷（cation）、兩性離子（zwitterion）及負(fù)電荷（anion）等三種，在酸性溶液中帶正電荷，在堿性溶液中帶負(fù)電荷。若氨基酸在某一pH值下其凈電荷為0，且在電場(chǎng)中不移動(dòng)時(shí)，稱此pH值為它的pI值（等電點(diǎn)）。
關(guān)鍵詞：電泳酰胺聚丙烯聚丙烯酰胺等電聚焦電泳蛋白質(zhì)等電點(diǎn)等電聚焦電泳isoelectricfocusingIEF
實(shí)驗(yàn)原理

所有的氨基酸均為兩性物質(zhì)，即它們至少含有一個(gè)羧基（carboxyl）及一個(gè)氨基（α-amino）。這些可游離的基團(tuán)隨著pH變化可以三種形式存在，即正電荷（cation）、兩性離子（zwitterion）及負(fù)電荷（anion）等三種，在酸性溶液中帶正電荷，在堿性溶液中帶負(fù)電荷。若氨基酸在某一pH值下其凈電荷為0，且在電場(chǎng)中不移動(dòng)時(shí)，稱此pH值為它的pI值（等電點(diǎn)）。因?yàn)閮綦姾蔀榱悖瑑綦姵饬Σ淮嬖诘木壒?，大部份蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的pH值下，其溶解度最小。相反的，當(dāng)溶液的pH值低于或高于pI，所有蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷為同號(hào)，彼此之間有相斥力，不會(huì)聚集。所以，將pH調(diào)到等電點(diǎn)的大小，則大部份的蛋白質(zhì)將會(huì)沉淀，這種現(xiàn)象可以應(yīng)用于估算某蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)；另一方面，也可以應(yīng)用在電泳，達(dá)到分離蛋白質(zhì)混合物的目的，這種方法稱為等電聚焦電泳（isoelectric focusing），簡(jiǎn)稱為IEF(見(jiàn)圖4.8)。

圖4.8 等電聚焦電泳示意圖

上圖左以A，B兩種蛋白質(zhì)為例，作出它們的凈電荷曲線圖，橫軸代表環(huán)境中的pH值，縱軸代表蛋白質(zhì)的凈電荷，在 pH 6.5時(shí)，A帶有兩個(gè)正電荷，B帶有一個(gè)負(fù)電荷。使A與B的凈電荷為0的pH值分別為pH9和pH5，這就是它們的「等電點(diǎn)」。

 IEF是在具有pH梯度環(huán)境中進(jìn)行的電泳。將蛋白質(zhì)置于不同pH梯度的膠體進(jìn)行電泳，它會(huì)朝著與自身所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)，直到抵達(dá)等電點(diǎn)（pI）相同的pH值處才停止，如果它移到別的pH處，會(huì)因?yàn)閹щ姸俣纫苿?dòng)到和它pI相符的pH處。

IEF-PAGE操作簡(jiǎn)單，只要一般電泳設(shè)備就可進(jìn)行，電泳時(shí)間短、分別率高、應(yīng)用范圍廣，可用于分離蛋白質(zhì)及測(cè)定pI，也可用于臨床鑒別診斷、農(nóng)業(yè)、食品研究等各種領(lǐng)域。

試劑和器材

一、試劑

Acr－Bis貯存液：29.1g Acr,0.9g Bis, 用無(wú)離子水溶解后定容至100ml,不溶物過(guò)濾去除后置棕色瓶貯于冰箱。

等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)蛋白（pH3－pH10）試劑盒，臨用前稀釋至0.1－0.3mg/mL。

適合于pH3－pH10范圍的電極溶液：

A: 陰極電極溶液（1mol/L NaOH）:稱NaOH(AR)4g，加去離子水使其溶解，冷卻至室溫再定容至100ml；

B: 陽(yáng)極電極溶液（1mol/L H3PO4）:取H3PO4（85％）6.7ml，加去離子水定容至100ml。

固定液：稱取磺基水楊酸3.5g，三氯乙酸10ml，甲醇35ml，加去離子水至100ml。

染色液：稱取考馬斯亮藍(lán)R250 0.1g，冰乙酸10ml，甲醇35ml，加去離子水使其完全溶解，在定容至100ml，過(guò)濾后置棕色瓶保存。

脫色液：取無(wú)水乙醇50ml，冰乙酸20ml，加蒸餾水至200ml。

保存液：取無(wú)水乙醇25ml，冰乙酸10ml, 甘油5ml，加蒸餾水至100ml。

10％過(guò)硫酸銨，TEMED, 40%兩性電解質(zhì)載體（pH3－pH10）。

二、材料

待測(cè)已純化的蛋白質(zhì)樣品（脫鹽），濃度0.5mg/mL。

三、器材

等電聚焦電泳槽, 移液管（1，5，10ml），燒杯（25，50，100ml），細(xì)長(zhǎng)頭的吸管，微量注射器（10μL或者50μL），漏斗，濾紙，鑷子。

操作方法

一、準(zhǔn)備工作

配制凝膠前，應(yīng)把玻璃板準(zhǔn)備好。即將兩塊干凈的玻璃板疊放在一起，之間夾上所需凝膠厚度的膠條進(jìn)行密封。然后用文具夾將玻璃板四周固定好。注意夾子作用力點(diǎn)在膠條正中，以防漏膠。

二、配制凝膠

取Acr-Bis儲(chǔ)備液2.0ml；兩性電解質(zhì)0.5ml；去離子水5.5ml；TEMED 8μl置于小燒杯中混勻，再加入10% 過(guò)硫酸胺50μl，用磁力攪拌器充分混勻2min。然后用注射器吸凈混合液，排除氣泡，緩緩注入玻璃板的夾隙內(nèi)。注意勿出現(xiàn)氣泡。

三、電泳

1. 剝膠板 將膠板取出，揭去上層的玻璃板和膠條，然后用蒸餾水輕輕沖洗一下膠面。

2. 點(diǎn)樣 用小紙條（0.5 cm′0.5cm）蘸樣，均勻地點(diǎn)在膠板上，點(diǎn)樣要求整齊、迅速。注意膠板兩邊要留出一定空間。通常把PI在酸性范圍的樣品放在偏堿性的位置（負(fù)極），PI偏酸性的樣品放在偏酸性的位置（正極），標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合樣品放在中間。

3. 進(jìn)樣 將浸入電極液的濾紙條取出，使其分別平直緊貼在膠面兩端，然后放入電泳槽內(nèi)，注意正負(fù)極相吻合。將電極板正極（電極條浸有H3PO4的一側(cè)）與負(fù)極（電極條浸有NaOH的一側(cè)）分別與電泳儀的正、負(fù)極連接。接通冷卻水，在室溫下電泳，把電泳儀調(diào)至電壓50V，電流以每板膠不超過(guò)17mA為準(zhǔn)，然后開(kāi)始電泳。進(jìn)樣時(shí)間一般在1.5－2小時(shí)。

4. 揭樣紙 待電流降至每板膠3mA以下時(shí)，切斷電源，取出膠板，揭去加樣紙后，將電壓調(diào)至220~320V繼續(xù)電泳。5. 加壓 當(dāng)電流降至每板膠3mA以下時(shí)，升高電壓至580V，繼續(xù)電泳1.5小時(shí)左右。

6. 電流降至每板3mA以下時(shí)，切斷電源，停止電泳。

四、固定、，染色和脫色

將凝膠板放在培養(yǎng)皿中，加入固定液，浸泡數(shù)小時(shí)后，用脫色液清洗兩次，每次10min, 然后加入染色液，室溫下放置15－30min，再用脫色液洗脫數(shù)次，直至譜帶清晰，放入保存液中浸泡10min,可制干板。

五、制作干膠板

1. 取完全浸濕的平整玻璃紙一張，于玻璃板上鋪平，紙與板之間不可有氣泡。

2. 將凝膠鋪于上述玻璃紙上，對(duì)齊中心位置，使四邊留出距離相等，隨后將膠與紙之間的氣泡輕輕趕跑。然后，把另一張玻璃紙折起蓋在膠面上，并與下層玻璃紙對(duì)齊，膠與兩層玻璃紙之間要絕對(duì)避免氣泡，要求光滑平整。

3. 將凝膠四邊上下兩層玻璃紙貼緊，使膠邊邊緣上完全沒(méi)有氣泡。然后將各邊的玻璃紙多余部分折向玻璃板反面。

4. 置于室溫中自然干燥，完全干燥后的膠板，手感如觸及玻璃板。這時(shí)，可將膠板揭下，裁去邊角多余的紙，即可得一張圖譜清晰的干膠板。

注意事項(xiàng)

（1）支持介質(zhì)

 在IEF-PAGE中，丙烯酰胺純度極為重要，Acr及Bis中如有丙烯酸，則引起聚焦后pH剃度漂移，一般需用重結(jié)晶法進(jìn)一步純化Acr及Bis。 最近Pharmacia公司推出Amberlite MB-6除去丙烯酸，其效果較再結(jié)晶法更佳。

（2）兩性電解質(zhì)載體

 兩性電解質(zhì)載體是IEF-PAGE中最關(guān)鍵的試劑，直接影響pH梯度的形成，以及蛋白質(zhì)

的聚焦。因此，要選用優(yōu)質(zhì)的兩性電解質(zhì)載體，在凝膠中，其終濃度一般為1-2%。pH梯度的線性依賴于兩性電解質(zhì)的性質(zhì)，選擇哪種pH梯度范圍的兩性電解質(zhì)載體，則與被分離蛋白質(zhì)的pI有關(guān)。

（3）樣品預(yù)處理與加樣方法

 實(shí)驗(yàn)證實(shí)，鹽離子可干擾pH梯度形成，并使區(qū)帶扭曲。為了防止上述影響，進(jìn)行IEF-PAGE時(shí)，樣品應(yīng)透析或用Sephadex G-25脫鹽，也可將樣品溶解在水，或是低鹽緩沖液中，使其充分溶解，以免不溶小顆粒引起拖尾。但某些蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近，或水溶液及低鹽溶液中，溶解度較低，則可在樣品中加入兩性電解質(zhì)，如加入1%甘氨酸或?qū)?%甘氨酸透析，雖然甘氨酸是兩性電解質(zhì)，但不影響pH梯度的形成，可利用其在溶液中的偶極距作用增加蛋白質(zhì)的溶解性。此外，還可在樣品及凝膠溶液中加入無(wú)離子去污劑如Tween 80, Triton X-100, Nonide P-40等或加入相同濃度的尿素(4 M)，以免氰酸鹽引起蛋白質(zhì)的胺甲酰化，含有尿素的樣品及凝膠板只能當(dāng)天使用。

 加樣量取決于樣品中蛋白質(zhì)的種類、數(shù)目及檢測(cè)方法的靈敏度。如用銀染色，加樣量可減少到1 μg。一般樣品濃度以0.5-3 mg/ml為宜，最適加樣體積為10-30 μl。如樣品很濃，可直接在凝膠表面加2-5 μl；如樣品很稀，可加樣300μl。值得注意的是：對(duì)不穩(wěn)定的樣品可先將凝膠進(jìn)行15-30 min預(yù)電泳使pH梯度形成，然后將樣品放再靠近pI的位置以縮短電泳的時(shí)間，但不要將樣品正好加在pI處和緊靠陽(yáng)、陰極的膠面上，以免引起蛋白質(zhì)變性造成區(qū)帶扭曲。一般加樣電泳半小時(shí)后，取出加樣濾紙以免引起拖尾現(xiàn)象。

 （4）電功率、時(shí)間等因素

在IEF電泳中，隨著樣品的遷移越接近pI時(shí)，電流則越來(lái)越小。為使各成分能更好

地分離，要保持一定的電功率，就應(yīng)不斷增加電壓，電壓增高可縮短pH梯度形成，和蛋白質(zhì)分離所需的時(shí)間，但過(guò)高的電壓會(huì)使凝膠板局部范圍過(guò)熱，因此，在電泳過(guò)程中，應(yīng)通冷卻水，水溫以4-10℃為宜，流量5-10 l/min。一般寬pH范圍電泳時(shí)間以1.5-2 h為宜。

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聚丙烯酰胺凝膠平板等電聚焦電泳測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（圖）