［PCR原理］
　　DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。在實驗中發(fā)現，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，加入設計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。
　　但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發(fā)展。
　　發(fā)現耐熱DNA聚合酶--Taq酶對于PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量應用，并逐步應用于臨床。
　　PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。
[編輯本段][PCR反應體系與反應條件]
　　標準的PCR反應體系
　　10×擴增緩沖液 10μl    
4種dNTP混合物 200μl    
引物 10～100μl    
模板DNA 0.1～2μg    
Taq DNA聚合酶 2.5 μl    
Mg2+ 1.5mmol/L    
加雙或三蒸水 100 μl    

　　PCR反應五要素： 參加PCR反應的物質主要有五種即引物(PCR引物為DNA片段，細胞內DNA復制的引物為一段RNA鏈)、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+)。
[編輯本段]［PCR步驟］
　　標準的PCR過程分為三步：
　　1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈DNA
　　2.退火（25℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。
　　3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。
　　每一循環(huán)經過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如圖所示：
　　現在有些PCR因為擴增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。
[編輯本段]［PCR檢測］
　　PCR反應擴增出了高的拷貝數，下一步檢測就成了關鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是最常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。近年來以熒光探針為代表的檢測方法，有逐漸取代電泳法的趨勢。
[編輯本段]［PCR反應特點］
　　特異性強
　　PCR反應的特異性決定因素為：
　?、僖锱c模板DNA特異正確的結合；
　?、趬A基配對原則；
　?、跿aq DNA聚合酶合成反應的忠實性；
　?、馨谢虻奶禺愋耘c保守性。
　　其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。
　　靈敏度高
　　PCR產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴增到微克(μg=-6)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。
　　簡便、快速
　　PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在2～4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。
　　對標本的純度要求低
　　不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等DNA擴增檢測。
[編輯本段]［PCR的循環(huán)參數］
　　1、預變性（Initial denaturation）．
　　模板DNA完全變性對PCR能否成功至關重要，一般95℃加熱3-5分鐘。
　　2、引物退火（Primer annealing）
　　退火溫度一般需要憑實驗（經驗）決定，一般為54℃。
　　退火溫度對PCR的特異性有較大影響。
　　3、引物延伸
　　引物延伸一般在72℃進行（Taq酶最適溫度）。
　　延伸時間隨擴增片段長短而定。
　　4、循環(huán)中的變性步驟
　　循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性：
　　變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴增失敗。
　　5、循環(huán)數
　　大多數PCR含25-35循環(huán)，過多易產生非特異擴增。
　　6、最后延伸
　　在最后一個循環(huán)后，反應在72℃維持5-15分鐘．使引物延伸完全，并使單鏈產物退火成雙鏈。
　?。ㄋ模㏄CR中的污染和假陽性
　　PCR中污染主要來自
　　1、樣品間交叉污染；
　　2、先前PCR產物遺留（carry-over）
[編輯本段][PCR儀器]
　　pcr儀器的發(fā)展
　　pcr溫度循環(huán)至關重要，pcr擴增儀各參數必須準確。自perkin –elmercetus公司第一臺pcr擴增儀問世以來，現已有幾十家不同的廠家在國內外生產和銷售pcr擴增儀。在短短的幾年間，擴增儀經過幾代的發(fā)展，不斷采用新技術，并且進一步朝方便、實用、高智能化和自動化的方向發(fā)展。
　　為了便于了解和選購適宜的pcr實驗設備，現將部分國內外pcr擴增儀列表如下；這些儀器主要用變溫鋁塊、變溫水浴及變溫氣流的方式達到熱循環(huán)的目的，各有其優(yōu)缺點。國產1109型dna擴增儀則是用恒溫浴機械手移位式。更接近于手工操作。ptc-51a/b體積小，智能化與自動化程序高，可以兼做套式pcr，方便實用。以上各種儀器一般都配有微電腦自動控制溫度、時間及循環(huán)數，可以達到節(jié)省勞動力的目的。在采用這些儀器作pcr試驗之前，一般均應實測管內溫度變化循環(huán)情況，以了解升、降溫時管內因熱傳導造成的溫度滯后情況和實際到達的最高、最低溫度，用于修正設計的循環(huán)參數。溫度滯后受到所用eppendorf管材料、壁厚及形狀（與鋁塊孔匹配程度）的影響，這對變溫鋁塊式儀器影響更大些。對于配用制冷機式半導體元件致冷的儀器，在使用低于室溫的溫度來保冷pcr反應后小管時，應注意冷凝水的問題，勿使流入儀器內浸濕半導體元件而損壞儀器。
　　國內外生產的幾種dna擴增儀
　　1109型
　　北京新技術所與軍科院聯合
　　機械臂
　　變溫水浴
　　電子調溫
　　40×0.5ml
　　16400元/臺
　　90a/b型
　　中科院遺傳所
　　機械臂
　　變溫水浴
　　電熱
　　14000元/臺
　　ptc-51a/b型
　　軍事醫(yī)學科學院
　　變溫氣流
　　電子調兼作套式
　　30×0.5ml
　　12000元/臺
　　dna thermal cycler
　　perkin –elmercetus(美)
　　變溫鋁塊
　　壓縮機致冷
　　48×0.5ml
　　us $ 20000.-
　　thermocycler
　?。?0
　　＃00
　?。?80
　　b..braun
　　biotech
　　(德)
　　變溫水浴98℃四檔
　　電熱,自來水冷卻
　　60×1.5ml
　　100×1.5ml
　　180×1.5ml
　　dm 30000.-
　　automatic temperature cy-cler single block twin block
　　ericomp inc.(美)
　　變溫鋁塊25～100℃
　　電熱,自來水冷卻
　　29×1.5ml
　　58×1.5ml
　　us $4985.-
　　us $7980.-
　　grant autogen
　　grant instrumant ltd(美)
　　變溫水浴0～99℃
　　電熱,自來水冷卻或加冷循環(huán)器
　　50×1.5ml
　　or
　　50×1.5ml
　　us $250. –plus
　　us $ 15.-for
　　rack(x2)
　　techne phc-1
　　phc-2
　　techne ltd.(英)
　　變溫鋁塊0～99℃三檔
　　電熱500w水冷100w
　　54×0.5ml
　　54×0.5ml
　　24×1.5ml
　　￡3383. –
　　￡3997. -
　　biooven
　　biothrm corp(美)
　　變溫氣流
　　-150℃
　　115v 11a
　　200’s of 4×96plate
　　us $ 2990. -
　　trio-thermo-block tb-1
　　biomertra(德) 半導體變溫
　　220v
　　3×20管
　　分別控溫
　　dm12900. -
　　micro cycler e
　　eppendorf(美) 變溫鋁塊
　　220v/100v
　　3×29管
　　us $ 3500. -
　　［PCR常見問題］
　　PCR產物的電泳檢測時間
　　一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。
　　假陰性，不出現擴增條帶
　　PCR反應的關鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及溴乙錠的使用， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。
　　模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。
　　酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。
　　引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。
　　Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
　　反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應用多 大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
　　物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
　　靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。
　　假陽性
　　出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。
　　引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。
　　靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。
　　出現非特異性擴增帶
　　PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引 物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數。適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。
　　出現片狀拖帶或涂抹帶
　　PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數。
　　克隆PCR產物
　　1)克隆PCR產物的最優(yōu)條件是什么？
　　最佳插入片段：載體比需實驗確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數比1：8或8：1也行。應測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液,50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時，或4℃過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會自連，產生藍斑。室溫保溫1小時能滿足大多數克隆要求，為提高連接效率，需4℃過夜。
　　2)PCR產物是否需要用凝膠純化？
　　如凝膠分析擴增產物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數也很高，這會產生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。
　　3)如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實驗？
　　A）涂布未轉化的感受態(tài)細胞。
　　如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質粒，或產生氨芐抗型的菌落。
　　B）轉化完整質粒，計算菌落生長數，測定轉化效率。
　　例如，將1ug/ul質粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細胞轉化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養(yǎng)過夜，產生1000個菌落。轉化率為： 產生菌落的總數/鋪板DNA的總量。
　　鋪板DNA的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數。具體而言轉化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉化率為：
　　1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug
　　轉化pGEM-T應用10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細胞
　　如沒有菌落或少有菌落，感受態(tài)細胞的轉化率太低。
　　C）如用pGEM-T正對照，或PCR產物，產生>20-40藍斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ug感受態(tài)細胞），表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。T4DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質量標準好無核酸酶污染，不應用其它來源的T4 DNA連接酶替換。
　　D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對照，轉化高頻率感受態(tài)細胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的實驗步驟，可得100個菌落，其中60%應為白斑，如產生>20-40藍斑, 沒有菌落或少有菌落，連接有問題。
　　4)對照實驗結果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什么問題？
　　A）連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數克隆，為提高效率，需4℃過夜。
　　B）插入片段帶有污染，使3`-T缺失，或抑制連接，抑制轉化。為此，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數，插入片段需純化，或重新制備。如產生大量的藍斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。
　　C）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時有發(fā)生。UV過度照射會產生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。
　　D）帶有修復功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產物末端無A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術資料（TM042）。
　　E）高度重復序列可能會不穩(wěn)定，在擴增中產生缺失和重排，如發(fā)現插入片段高頻率地產生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細胞
　　PCR反應體系與反應條件
　　標準的PCR反應體系：
　　10×擴增緩沖液 10ul
　　4種dNTP混合物 各200umol/L
　　引物 各10～100pmol　
　　模板DNA 0.1～2ug　
　　Taq DNA聚合酶 2.5u　
　　Mg2+　1.5mmol/L
　　加雙或三蒸水至 100ul
　　PCR反應五要素： 參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
　　引物： 引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
　　設計引物應遵循以下原則：
　?、僖镩L度： 15-30bp，常用為20bp左右。
　?、谝飻U增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。
　?、垡飰A基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
　?、鼙苊庖飪炔砍霈F二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。
　?、菀?'端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
　　⑥引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
　　⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。
　　酶及其濃度　目前有兩種Taq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。
　　dNTP的質量與濃度　dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。
　　模板(靶基因)核酸　模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一，傳統的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質結合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
　　Mg2+濃度　Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。
　　PCR反應條件的選擇
　　PCR反應條件為溫度、時間和循環(huán)次數。
　　溫度與時間的設置：基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。
　?、僮冃詼囟扰c時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃min足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就會導致PCR失敗。
　?、谕嘶?復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結合。由于模板DNA比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
　　Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)
　　復性溫度=Tm值-(5～10℃)
　　在Tm值允許范圍內， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合， 提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。
　　③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性：
　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子
　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子
　　高于90℃時， DNA合成幾乎不能進行。
　　PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。
[編輯本段]PCR實驗室的建立方法
　　1、實驗室布局
　　PCR實驗室按規(guī)定需要四間，分別是1 試劑儲存和準備區(qū)、2 標本制備區(qū)、3擴增反應混合物配制和擴增區(qū)、4擴增產物分析區(qū),布局見圖1。
　　圖1 四間PCR實驗室區(qū)域設置
　　如果使用全自動分析儀，各區(qū)域可適當合并，我們建議將擴增區(qū)和產物分析區(qū)合并為擴增檢測區(qū)即共三個間，布局見圖2。
　　圖2 三間PCR實驗室區(qū)域設置
　　按國家衛(wèi)生部的要求，進入各個工作區(qū)域必須嚴格遵循單一方向順序，即只能從試劑儲存和準備區(qū)?標本制備區(qū)擴增反應混合物配制和擴增區(qū)?擴增產物分析區(qū)，避免發(fā)生交叉污染。各工作區(qū)必須安裝適當的排風設備確?？諝饬飨虬磫我环较颉９ぷ鲄^(qū)的墻面、地面、辦公用品等必須選用耐消毒藥品腐蝕的材料。工作區(qū)必須有明確的標記，避免不同工作區(qū)域內的設備、物品混用。
　　2、設置標準
　　各工作區(qū)域必須配備排風扇、空調、耐腐蝕地面和工作臺面、更衣柜、鞋柜、專用辦公用品、專用工作服和工作鞋、移動紫外燈等，保證安全衛(wèi)生需要。
　　根據國家衛(wèi)生部《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設置標準》，各工作區(qū)域必備儀器設備如下：
　?。ㄒ唬?試劑儲存和準備區(qū)
　　1、2-8℃和-15℃冰箱
　　2、混勻器
　　3、微量加樣器（覆蓋1-1000μl）
　　4、移動紫外燈（近工作臺面）
　　5、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）
　　6、專用工作服和工作鞋
　　7、專用辦公用品
　?。ǘ吮局苽鋮^(qū)
　　1、2-8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱
　　2、高速臺式冷凍離心機
　　3、混允器
　　4、水浴箱或加熱模塊
　　5、微量加樣器（覆蓋1-1000μl）
　　6、可移動紫外燈（近工作臺面）
　　7、超凈工作臺
　　8、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）
　　9、專用工作服和工作鞋
　　10、專用辦公用品
　　如需處理大分子DNA，應具有超聲波水浴儀。
　?。ㄈ┗驍U增區(qū)和產物分析區(qū)
　　1、 全自動定量核酸擴增儀（含計算機、打印機）
　　2、 微量加樣器（覆蓋1-1000μl）
　　3、 可移動紫外燈（近工作臺面）
　　4、 消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）
　　5、 專用工作服和工作鞋
　　6、 專用辦公用品
　　各工作區(qū)域必須有明確的標記，避免不同工作區(qū)域內的設備、物品混用。在不同的工作區(qū)域應使用不同顏色或有明顯區(qū)別標志的工作服，以便于鑒別。當工作者離開工作區(qū)時，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。
　　3、實驗室質量管理
　　PCR實驗室內工作人員必須參加由國家衛(wèi)生部或各省臨床檢驗中心舉辦的臨床基因擴增培訓班，并持證上崗。PCR實驗室通過驗收，實驗室至少必須應有兩個以上持有“臨床基因檢測上崗證”。PCR實驗室必須建立嚴格的實驗室管理制度、建立標準化操作程序（SOP）、建立系列質量管理文件等，確保實驗室日常運行符合國家衛(wèi)生部的要求，確保檢測結果準確、確保實驗室衛(wèi)生安全，確保實驗室長期穩(wěn)定運行。